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免疫組化非特異性染色的八大原因
更新時間:2019-04-12   點擊次數(shù):5198次

免疫組化非特異性染色的八大原因

     免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry),是一項利用抗原抗體反應(yīng),通過使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原,對蛋白定位,定性的實驗技術(shù)。

    然而,結(jié)果卻未必都是那么如意的,常常出現(xiàn)下面這種狀況,好好的一張片子染得臟臟的,這就是常見的非特異性染色。

     1. 抗體問題

     一抗用多克隆抗體容易出現(xiàn)非特異性染色,建議用高純度,價的針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。單克隆抗體很貴,不過結(jié)果真的很好。尤其是背景非特異性染色不會太深。真是一分價錢一分貨。一抗過期也會造成杯具,所以要注意抗體的有效期。

     2. 抗體濃度過高/孵育時間過長

     一抗?jié)舛忍咭彩浅霈F(xiàn)非特異性染色的常見原因。解決的辦法就是預(yù)實驗。每次使用新抗體前應(yīng)該多做預(yù)實驗,摸索出適合的工作濃度,不能簡單地按照說明書來用。另一個常見原因就是孵育時間過長。解決的辦法就是定時器。加上抗體后,立刻調(diào)好定時器,提醒自己及時終止反應(yīng),就會避免這個問題。

     3. DAB染色時間太長/變質(zhì)

     DAB的孵育時間過長,會造成背景非特異性染色。DAB的顯色時間不是一成不變的,主要靠自己在顯微鏡下盯著,一旦出現(xiàn)淺淺的棕色的時候,就要馬上沖洗。出現(xiàn)棕色的時間過短,表明抗體濃度過高;出現(xiàn)棕色的時間過長,表明抗體濃度過低。DAB要保存于避光干燥的地方,現(xiàn)用現(xiàn)配,臨用前才加入H2O2。圖1就沖洗的有些晚了;圖2就是剛剛好,染色效果棒棒噠!

     4. 內(nèi)源性酶和生物素

     內(nèi)源性酶和生物素也會造成非特異性染色,特別是一些內(nèi)源性酶生物素含量豐富的組織,如肝臟,腎臟,脾臟等。處理的辦法為:滅活堿性磷酸酶:常用的方法是將左旋咪唑(24 mg/mL)加入底物液中,并保持PH值在7.6-8.2,即能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶;對于酸性磷酸酶,可以用50 mmol/L的酒石酸抑制;對于內(nèi)源性過氧化物酶,可以用0.9%的雙氧水來滅活。對于內(nèi)源性生物素,染色前將切片浸于25 μg/mL親和素溶液中15分鐘,PBS清洗15分鐘后即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分鐘。

     5. 組織變干

     一下子染太多片子的時候,容易出現(xiàn)這種情況。解決的辦法就是不要貪多嚼不爛。一次少染幾張。還有就是試劑充分覆蓋組織,超出組織邊緣2 mm。然后用PAP筆在組織周圍畫一個圈圈,把試劑圈在里面。避免修復(fù)液流走。圈圈應(yīng)該距離組織邊緣3-4 mm。

     6. 浸泡時間過長

     切片在緩沖液或修復(fù)液里面浸泡過夜,也會引起杯具。這都是偷懶的做法。但是有時候也是可以偷一下懶的。毛博的獨門秘技就是4°C冰箱。只要把容器放在4°C冰箱里,過夜*沒有問題。

     7. 清洗不充分

     清洗一定要充分。PBS液一定要雙蒸水新配,用之前再次測PH值。緩沖液用0.05 mol/L的Tris-HCL,0.15 mol/L的NaCl即可。如果加一點去垢劑Tween-20就更好了。

     8. 封閉血清問題

     是否選擇了正確的封閉血清。原則是選擇二抗動物的非免疫血清,例如二抗是羊抗兔,就要選擇非免疫羊血清。用PBS稀釋為3-10%的溶液孵育切片,37°C 10-30分鐘。這里不用洗,直接甩掉即可。

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