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免疫組化實驗要點
更新時間:2019-05-30   點擊次數(shù):2922次

 

樣本來源   

對于IHC,組織是來自患者或動物,經(jīng)過冷凍或石蠟包埋。然后切成約4μm厚的切片。對于ICC,大部分細(xì)胞外基質(zhì)被去除,只剩下整個細(xì)胞來染色,來源可以是細(xì)胞懸液,或組織培養(yǎng)細(xì)胞系。

然而IHC遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止于把抗體放在組織切片上、然后用顯微鏡觀察那么簡單。要想得到實用、可靠而清晰的結(jié)果,就需要耐心的對每一步進行優(yōu)化。根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法和免疫酶法,R&DSystems的網(wǎng)站列出了IHC/ICC實驗設(shè)計和優(yōu)化的變量及影響因素如下:

樣本類型:組織或細(xì)胞

樣本制備:組織(石蠟或冰凍),細(xì)胞:(貼壁細(xì)胞或細(xì)胞懸液

適當(dāng)對照:無一抗,組織類型。

固定方法:灌注或浸泡。

固定劑:甲醛,醇類,丙酮。

封閉液:正常血清,牛血清蛋白(BSA)或脫脂奶粉。

抗原修復(fù):蛋白酶,加熱。

檢測方法:直接或間接

一抗:物種

二抗:物種

標(biāo)記物:熒光或酶(顯色)

復(fù)染劑:蘇木精或DAPI(熒光)

封片劑:抗淬滅或水性

顯微鏡觀察:熒顯微鏡或光學(xué)顯微鏡

處理不同樣本的區(qū)別 

ICC需要透化,要么通過固定過程,要么是單獨的透化步驟,而IHC可能不需要單獨的透化步驟,這取決于切片的厚度和固定方法。包埋在石蠟中的組織樣本在抗體染色前需要進一步處理。一旦處理好樣品,IHCICC的染色操作就幾乎沒什么差異了。

樣本固定和制備

組織石蠟包埋前的組織固定:4%甲醛固定劑是組織灌注和浸潤固定的常用溶液,一般需要424h,能很好地保留組織形態(tài),切片機切片,貼附于載玻片干燥,石蠟切片存儲室溫多年,后續(xù)進行IHC/ICC之前需要再水化,需要抗原修復(fù)。

培養(yǎng)細(xì)胞固定:2%甲醛室溫固定20min,細(xì)胞樣本貼附載玻片,對于貼壁細(xì)胞直接放在6孔或24孔底部的無菌載玻片上生長,懸浮細(xì)胞可通過與包被多聚賴氨酸的載玻片孵育10min而附著在載玻片上。

冰凍組織切片固定:切片后用醇類固定,用于檢測磷酸化依賴的表位,在低溫箱進行樣本切片,冰凍切片存儲–80℃多達一年。通常保留酶的活性和抗原功能,不需要抗原修復(fù),冰晶的形成可能負(fù)面影響組織結(jié)構(gòu)。

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